在滲透的作用下，原油中的烷烴類分子穿過細胞膜;再在降解酶的作用下，烷烴類分子被轉化為槐糖脂類生物表面活性劑。生物表面活性劑的產生有利于廢水中污油組分的乳化增溶，進而提高S.bombicola對石油烴的攝取效率。

圖3(a)、(b)為S.bombicola在油濃度為0.5%廢水中生長第1天和第10天時的TEM照片，圖3(c)為未添加O-13-1菌株的降解體系中土著菌群細胞的TEM照片。在降解第1天時，部分O-13-1菌株內部有透明液泡，并在降解第10天時逐漸變大，推測為所含原油中烷烴類物質凝聚而成。這與Singer等的研究結果基本一致，他們發(fā)現(xiàn)不動桿菌(Acinetobactersp.)HO1-N在降解正構烷烴后，HO1-N菌體細胞內部出現(xiàn)由烷烴構成的透明囊泡。而未添加O-13-1菌株的降解體系中，石油烴類物質難以通過被動運輸直接進入細胞內，故細胞內鮮有液泡產生。O-13-1菌體細胞內烷烴液滴的出現(xiàn)說明在槐糖脂類表面活性劑的作用下，烷烴從胞外到胞內的運輸過程大大增快，從而有利于胞內烴氧化酶的吸收利用。

圖3培養(yǎng)體系中添加球擬假絲酵母菌培養(yǎng)1d(a)、10d(b)和未添加球擬假絲酵母(c)細胞結構的變化

2.2菌株O-13-1強化降解石油烴產生物表面活性劑的結構鑒定

2.2.1菌株O-13-1強化降解含油廢水的表面張力

不同培養(yǎng)體系經(jīng)10d降解后表面張力變化如表2所示。油濃度為0.8%、0.5%和0.3%的培養(yǎng)液表面張力分別為36.9、38.0和47.8 mN/m，相較于對照組分別降低了22.1、18.3和9.3 mN/m。其中，油濃度為0.8%和0.5%的培養(yǎng)體系的表面張力均小于槐糖脂溶液的臨界膠束濃度(CMC)所對應的最低表面張力(37.0 mN/m)。該結果說明了O-13-1菌株以采油廢水作為發(fā)酵底物產生的槐糖脂具有較高的應用效率。

目前，油田采出廢水主要用于回注油藏繼續(xù)進行注水采收。由于石油開采過程對回注水水質要求較高，污水對油藏適應性差且水驅采收率低下等原因，油田采出水循環(huán)利用效率較低。將采油廢水作為槐糖脂的發(fā)酵碳源，大量含有易生物降解、高表面活性的生物表面活性劑的回注水為三次采油提供了新的思路。

表2不同培養(yǎng)體系經(jīng)10d降解后的廢水中的表面張力和槐糖脂產量

注:-:未檢測出。Nodetected.

2.2.2菌株O-13-1產表面活性劑結構初步鑒定

三組實驗發(fā)酵結束后均能利用乙酸乙酯提取出棕黃色物質，TLC可定性分析菌株O-13-1發(fā)酵得到的粗提產物。粗提產物與槐糖脂純品的TLC結果對比如圖4所示。由圖可知，粗提產物(1)顯棕黃色且與槐糖脂純品(2)顯色較深的點位置相同，說明粗提產物中有糖脂存在。同時，計算該點對應化合物的比移值(Rf)均為0.65左右，與文獻報道的槐糖脂內酯分子的Rf值相一致。據(jù)此，可初步判定粗提產物中存在槐糖脂。

圖4假絲酵母菌產表面活性劑薄層層析(TLC)其中(1)為粗提產物;(2)為槐糖脂純品標準物質。

2.2.3菌株O-13-1產表面活性劑HPLC-MS結構鑒定

圖5和圖6分別給出了假絲酵母菌O-13-1降解原油純化產物的HPLC-MS總離子流圖和保留時間為3.1min的組分質譜圖。可以看出，該純化物質含有11種酸型或內酯型槐糖脂同系物，其中保留時間為2.1、2.5 min為酸型槐糖脂，其余均為內酯型槐糖脂。這與HuYongmei等的研究成果基本相同，他們發(fā)現(xiàn)在以十六烷為碳源發(fā)酵生產槐糖脂時，內脂型槐糖脂在產物中占多數(shù)。在此培養(yǎng)體系槐糖脂的生物合成途徑中，主要步驟為細胞色素P450單加氧酶介導的烷烴氧化成脂肪醇，隨后通過衍生醇和醛的氧化進一步轉化為脂肪酸，因此，槐糖脂的結構與生產所用碳源有密切關系。

保留時間為3.1 min時色譜峰豐度最高。對該物質進行詳細分析，質荷比(m/z)645.32的碎片為單乙酰基取代的內酯型槐糖脂的分子離子峰，m/z 667.32為[M+Na]+峰，m/z 483.29為[M+H-C8H12O6]+峰，其中C8H12O6為乙酰基取代糖環(huán)。上述分析表明此物質為內酯型槐糖脂，具體名稱為:17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)-O-]十八二烯酸-1'，4″-內酯-6″乙酸酯。

另外，保留時間為6.5、6.9min的峰具有相同的主要離子碎片，二者可能互為同分異構體。已有文獻證明，在槐糖內脂的形成過程中，大多數(shù)脂肪酸通過ω-1位置連接，因此ω型槐糖脂含量較低。保留時間為6.5 min時色譜峰豐度比6.9 min較小，故保留時間為6.5 min對應組分為ω型槐糖脂，保留時間為6.9 min對應組分為ω-1型槐糖脂。利用質譜將槐糖脂純化物電離成具有不同質量的離子，得到不同保留時間的峰的離子信息，進而得到槐糖脂同系物的具體信息，見表3。綜上，可確定球擬假絲酵母菌O-13-1在降解采油廢水中石油烴組分的同時，分泌了生物表面活性劑槐糖脂。

圖5 O-13-1菌株產槐糖脂HPLC-MS總離子流圖

圖6保留時間3.1 min組分的質譜

表3球擬假絲酵母菌O-13-1所產槐糖脂同系物結構鑒定

3結論

(1)O-13-1菌株在原油濃度0.8%、0.5%和0.3%水平下中等碳數(shù)(C17—C28)組分生物降解率分別為7.0%~12.8%、17.9%~44.0%和4.5%~27.7%，結果表明O-13-1菌株在發(fā)酵過程中可利用采油廢水中原油的正構烷烴組分作為碳源生長。

(2)對發(fā)酵產物的鑒定及結構分析表明，O-13-1菌株利用采油廢水發(fā)酵所產表面活性劑中含有11種由乙酰基取代的內酯型和酸型槐糖脂同系物，其中2種為酸型槐糖脂，其余為內脂型。所產槐糖脂中含量最高的是17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)-O-]十八二烯酸-1'，4″-內酯-6″乙酸酯。在以采油廢水為碳源的發(fā)酵實驗中，原油濃度為0.8%、0.5%和0.3%的三組發(fā)酵液表面張力相較于空白組分別降低了37.5%、32.5%和16.3%。結果表明O-13-1菌株以采油廢水作為發(fā)酵底物產生的槐糖脂具有較高的應用效率，為采油廢水的回注處理及三次采油提供了新思路。